تصحیح عاملی به عنوان ابزاری برای از بین بردن تنوع بین جلسه در آزمایشات تکرار: کاربرد زیست شناسی مولکولی و ویروسیولوژی

این یک مقاله دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز انتساب Creative Commons (http://creativeecommons.org/licenses/by/2. 0) توزیع شده است ، که امکان استفاده ، توزیع و تولید مثل بدون محدودیت را در هر رسانه ای فراهم می کند ، مشروط بر اینکه کار اصلی باشد. به درستی استناد شده

خلاصه

زمینه

در زیست شناسی تجربی ، از جمله رتروویرولوژی و زیست شناسی مولکولی ، جلسات اندازه گیری تکثیر اغلب تفاوتهای متناسب مشابه بین شرایط تجربی را نشان می دهد ، اما مقادیر مطلق مختلف ، حتی اگر اندازه گیری ها احتمالاً تحت شرایط یکسان انجام شود. اگرچه برنامه های آماری علیرغم این خطای تکثیر ، تجزیه و تحلیل اثرات شرط را امکان پذیر می کنند ، اما این رویکرد به سختی برای این منظور استفاده نمی شود. در مقابل ، بیشتر محققان با عادی سازی یا استاندارد سازی داده ها با چنین تغییرات بین جلسه برخورد می کنند. در عادی سازی ، تمام مقادیر در یک جلسه با مقدار مشاهده شده از شرایط "کنترل" تقسیم می شوند ، در حالی که در استاندارد سازی ، از میانگین جلسات و انحراف استاندارد برای اصلاح داده ها استفاده می شود. با این حال ، عادی سازی تغییر می کند زیرا مقدار کنترل بدون خطا نیست ، در حالی که اگر مجموعه داده ناقص باشد ، استاندارد سازی مغرضانه است.

نتایج

در بیشتر موارد ، تغییر بین جلسه چند برابر است و بنابراین می تواند با تقسیم داده ها در هر جلسه با یک عامل اصلاح خاص جلسه حذف شود. با فرض یک سطح از خطای بین جلسات بین جلسه ، عوامل جلسه بی طرفانه می توانند از طریق تولید یک ماتریس نسبت بین جلسه از کلیه داده های موجود محاسبه شوند. از طرف دیگر ، این عوامل را می توان با یک رویکرد حداکثر احتمال تخمین زد. اثربخشی این روش تصحیح ، لقب "تصحیح فاکتور" ، با نمونه هایی از زمینه زیست شناسی مولکولی و ویروسی شناسی نشان داده شده است. به خصوص هنگامی که همه شرایط در هر جلسه اندازه گیری گنجانده نشده است ، تصحیح فاکتور منجر به خطای باقیمانده کوچکتر از عادی سازی و استاندارد سازی می شود و بنابراین امکان تشخیص تفاوت های درمانی کوچکتر را فراهم می کند. تصحیح فاکتور به یک برنامه رایانه ای آسان برای استفاده که در صورت درخواست در دسترس است ، اجرا شد: ROTCAF=TCEJBUS؟LN. AVU. CMA@SECIVRES-BALOIB.

نتیجه

تصحیح فاکتور یک روش مؤثر و کارآمد برای مقابله با تنوع بین جلسه در آزمایش های چند جلسه است.

زمینه

In experimental biology, including retrovirology and molecular biology, replicating a series of measurements under presumably identical circumstances often leads to results that show the same proportional differences between experimental conditions, but very different absolute values within each of the conditions. As an example Figure Figure1A 1A shows data from a multi-session experiment in which multiple promoter-luciferase-reporter constructs were transfected into hepatoma cells. Luciferase activity was quantified two days after transfection [1]. Although the different constructs demonstrate a similar patte of luciferase activity in each of the sessions, the activity for some of the constructs can vary up to 30-fold in different sessions. This between-session variation results from small, but systematic, differences in e.g. cell density, substrate and reagent concentration, reaction temperature and exposure time, which all can be shown to proportionally increase or decrease the outcome of all biological measurements in a session [2]. The between-session variation can therefore be modelled as a multiplicative factor working on the data in each session. As exemplified in Figure Figure1A, 1A , the between-session variation can be very large and may conceal differences between the activities of the different constructs. A pair-wise comparison of each of the DNA constructs with construct 1 indeed revealed no statistically significant differences in the measured data (Fig. (Fig.2A; 2A ; t-test, all P>0. 4). یکی از راه های آزمایش اینکه آیا فعالیت سازه ها با وجود این تغییر بین جلسات متفاوت است ، استفاده از تجزیه و تحلیل واریانس (ANOVA) است. با این حال ، حتی اگر این روش در برنامه های آماری موجود باشد ، ANOVA به سختی برای این منظور در بیوشیمی ، ویروس شناسی یا زیست شناسی مولکولی مورد استفاده قرار می گیرد زیرا این برنامه ها برای غیر Expert دقیق و دشوار هستند. در عمل ، بیشتر محققان از روش "عادی سازی" خود استفاده می کنند ، که اغلب در بخش روش های مقاله به ندرت تأیید نمی شود و به ندرت ذکر می شود. اهمیت استفاده از روشهای آماری خوب و قابل اعتماد اخیراً به تفصیل در زمینه ویروس شناسی مورد بحث قرار گرفته است [3] اما بدیهی است که همه رشته های زیست شناسی تجربی و پزشکی را در خود جای داده است [4]. با این حال ، در این مقالات ، رسیدگی به این تغییر بین جلسه مورد بحث قرار نمی گیرد. مقاله حاضر در نظر دارد با توجه به حذف تنوع بین جلسه ، شکاف بین نظریه آماری و عمل آزمایشگاهی را ایجاد کند.

مقایسه عادی سازی ، استاندارد سازی و تصحیح فاکتور. سازه های DNA حاوی توالی های تقویت کننده ، پروموتر و اینترون مختلف از ژن سنتتاز گلوتامین موش همراه با ژن گزارشگر لوسیفراز کرم شب تاب به سلولهای FTO-2B منتقل شدند. فعالیت لوسیفراز 64 ساعت پس از ترانسفکشن اندازه گیری شد [1]. این طرح فعالیت 8 سازه DNA مختلف (= شرایط) را در 6 جلسه اندازه گیری مستقل اندازه گیری می کند (◆ □ ▲ ▲ ●). پاسخ: اندازه گیری های اصلی ، روی محور y لگاریتمی ترسیم شده است. خطوط تقریباً موازی که نتایج حاصل از هر جلسه را به هم وصل می کنند نشان می دهد که بیشتر تغییرات بین جلسات چند برابر است. ب: داده ها پس از عادی سازی ، استفاده از شرط 1 به عنوان "کنترل" (یک جلسه [◆] شامل شرط 1 نبود و مجبور به کاهش شد). توجه داشته باشید که تغییر در شرایط کنترل ('C') از بین می رود. ج: داده ها پس از استاندارد سازی. توجه داشته باشید که برای فعال کردن این طرح لگاریتمی ، یک تغییر خطی از مقادیر استاندارد (استاندارد* = 410 + 305 × استاندارد) مورد نیاز بود. د: داده ها پس از اعمال تصحیح فاکتور. حداقل فاصله باقیمانده بین خطوط نشان می دهد که تصحیح فاکتور در از بین بردن تنوع بین جلسات چند ضلعی مؤثر است.

مقایسه عادی سازی ، استاندارد سازی و تصحیح فاکتور. میانگین (و SEM) داده های مجموعه داده های مولکولی بیولوژی از شکل 1 a: داده های اصلی. ب: داده های عادی. ج: داده های استاندارد. D: داده ها پس از تصحیح فاکتور. توجه داشته باشید که عادی سازی ، استاندارد سازی و تصحیح فاکتور تغییرات در هر شرایط را کاهش می دهد. با این حال ، عادی سازی (B) منجر به از بین رفتن واریانس در شرایط کنترل ('C') و به تغییر در شرایط دیگر می شود. استاندارد سازی (ج) از این مجموعه داده ناقص منجر به افزایش تنوع ، در مقایسه با تصحیح فاکتور ، در برخی شرایط می شود. با تصحیح فاکتور (د) همه شرایط واریانس آماری خود را حفظ می کنند ، که به طور کلی از بعد از عادی سازی و استاندارد سازی کوچکتر است. ستاره نشان دهنده تفاوت آماری معنی داری بین سازه DNA و ساخت 1 است (آزمون t ؛ P<0.05). Note that the number of observations per construct in these comparisons ranges from 2 to 5.

محبوب ترین روش هایی که برای حذف تغییرات بین جلسه در تحقیقات زیستی پزشکی استفاده می شود "عادی سازی" و "استاندارد سازی" است [5]. در عادی سازی ، یک شرط "کنترل" تعریف شده و در هر جلسه همه مقادیر اندازه گیری شده (y_ni) با مقدار کنترل در جلسه تقسیم می شوند (معادله 1 ، با جلسه N ، شرط I و شرایط کنترل 1).

بنابراین یک شرایط کنترل واحد برای خدمت به عنوان یک عامل تصحیح انتخاب می شود (100/y_n1در Eq1)شکل 1B 1B داده های شکل 1A 1A را هنگام عادی سازی ، با استفاده از ساخت DNA 1 به عنوان کنترل ، نشان می دهد. از آنجا که ساخت DNA 1 در یک جلسه از بین رفت (◆) عادی سازی منجر به از بین رفتن این کل جلسه شد. عادی سازی برخی از تغییرات بین جلسه را از بین می برد اما به دلیل اینکه شرایط کنترل خود خطای بیولوژیکی دارد ، این می تواند منجر به افزایش تغییر شود. تغییر در سازه های 6 و 8 ، یعنی ، پس از عادی سازی در مقایسه با داده های اصلی بسیار بزرگتر است (شکل های شکل 2A 2A و AND2B را مقایسه کنید). 2b). اشکال دیگر عادی سازی این است که بدون تغییر یک شرایط کنترل ایجاد می کند. از آنجا که تست های آماری پارامتری برای مقایسه دو یا چند شرط ، واریانس مساوی را در همه شرایط فرض می کنند [6] از این آزمایشات دیگر قابل استفاده نیست. همچنین بیشتر تست های غیر پارامتری دیگر قابل اجرا نیستند ، زیرا در همه شرایط به توزیع مشابهی نیاز دارند [7].

در استاندارد سازی [5] ، هر مقدار در هر جلسه با کم کردن میانگین جلسه () و تقسیم نتیجه توسط انحراف استاندارد جلسه به یک مقدار استاندارد تبدیل می شود (SD_n، Eq2)

از آنجا که میانگین جلسه پس از استاندارد سازی برای هر جلسه صفر می شود ، استاندارد سازی تغییر بین جلسه را از بین می برد (شکل (شکل 1C). 1C). با این حال ، مقیاس اندازه گیری اصلی از بین می رود و میانگین کلی صفر می شود. علاوه بر این ، اگر همه شرایط در هر جلسه وجود نداشته باشد ، میانگین جلسه و انحراف استاندارد مغرضانه خواهد بود. از آنجا که انحراف استاندارد به عنوان ضریب تصحیح چند برابر عمل می کند ، این تعصب می تواند منجر به تغییرپذیری اضافه شده بین جلسات شود (همانطور که برای جلسات نشان داده شده با مثلث ها و الماس های پر شده در شکل 1 مشاهده شده است). 1c). بنابراین ، استاندارد سازی فقط می تواند به طور مؤثر مورد استفاده قرار گیرد که مجموعه داده ها کامل شود ، یعنی وقتی همه شرایط در هر جلسه وجود دارد.

همانطور که در بالا ذکر شد ، تنوع بین جلسه به دلیل عوامل جلسه چند برابر است. در صورت شناخته شدن ، از این عوامل می توان برای اصلاح داده ها استفاده کرد. همانطور که در پاراگرافهای قبلی نشان داده شد ، عادی سازی و استاندارد سازی هر دو از عوامل تصحیح استفاده می کنند که می تواند منجر به اصلاح ناکارآمد یا حتی افزایش در شرایط شود. برای اینکه یک روش تصحیح مؤثر باشد ، عوامل تصحیح باید بر اساس تمام مشاهدات موجود در جلسه باشد و تخمین این عوامل نباید تحت تأثیر مجموعه داده های ناقص باشد. در این مقاله چنین روش تصحیح ، لقب "تصحیح فاکتور" و دو رویکرد برای تخمین عوامل تصحیح ارائه شده است. در وهله اول ، "نسبت" ، به تغییر در مجموعه داده ها فرض می شود که به اثرات شرط محدود می شود ، در حالی که در دوم ، رویکرد "حداکثر احتمال" بخشی از تنوع ممکن است ناشی از تغییر در بین عوامل مؤثر در اندازه گیری فردی باشد. هر جلسههر دو رویکرد به نظر می رسد که عوامل تصحیح بسیار مشابهی دارند. استفاده و اثربخشی آنها با استفاده از مجموعه داده های زیست شناسی مولکولی و ویروسی شناسی نشان داده شده است.

نتایج

مدل افزودنی و چند برابر مخلوط

در مجموعه داده های مولکولی بیولوژی که در شکل 1A ، 1A ترسیم شده است ، سازه های مختلف DNA شرایط آزمایشی را نشان می دهند. داده های حاصل از آزمایش های ترانسفکشن در روزهای مختلف جلسات اندازه گیری است. ماهیت چند برابر تغییرات بین جلسه در این مجموعه داده از این واقعیت آشکار است که خطوط اتصال نقاط داده در هر جلسه تقریباً در یک نقشه لگاریتمی داده ها به طور موازی اجرا می شوند (شکل (شکل 1A). 1A)بشردر یک آزمایش چند جلسه با چنین تنوع بین جلسات ، مشاهدات را می توان با یک مدل افزودنی و چند برابر مخلوط توصیف کرد (معادله 3).

قسمت افزودنی این مدل ، بین پرانتز ، بیان می کند که نتیجه اندازه گیری Y در شرایط I ، مجموع جمعیت است (y_{منظور داشتن}) ، تأثیر شرط I (e_i) ، و یک خطای آزمایشی. توجه داشته باشید که "اثر" به معنای مورد استفاده در اینجا تفاوت بین یک کنترل و یک شرایط آزمایشی را نشان نمی دهد ، اما مخفف تأثیر هر شرایط نسبت به میانگین جمعیت است. بنابراین ، مجموع اثرات شرط 0 () است. در این مدل خطای بیولوژیکی به طور معمول با میانگین 0 و انحراف استاندارد σ توزیع می شود. این خطای بیولوژیکی واریانس را در یک شرایط منعکس می کند ، در حالی که اثرات شرایط منعکس کننده تفاوت بین شرایط است [6]. برای هر جلسه n ، قسمت افزودنی مشاهده توسط فاکتور جلسه f ضرب می شود_nبشرمحصول عوامل جلسه برابر است با 1 () ، که اطمینان می دهد که میانگین y_niهنوز هم برابر با y کلی است_{منظور داشتن}.

عوامل جلسه را می توان از کلیه داده های موجود در مجموعه داده های چند جلسه با دو روش مختلف تخمین زد: محاسبه یک ماتریس نسبت بین جلسه (رویکرد نسبت) یا یک رویکرد حداکثر احتمال.

تخمین فاکتورهای جلسه با رویکرد نسبت

برای برآورد فاکتورهای جلسه با روش نسبت برای هر جفت جلسات ، یک نسبت بین جلسه محاسبه می شود (معادله 4). به عنوان مثالجلسه 5 و 6 و شرط I ، این نسبت:

در چنین نسبت بین جلسه ، قسمتهای افزودنی معمولی توزیع شده از مدل چند جلسه (y_{منظور داشتن} + E_i+ خطا_ni) ، دارای همان میانگین و انحراف استاندارد ، و از این رو نسبت 1 از 1. خطای چنین نسبت متغیرهای عادی توزیع شده دارای توزیع کوشی است [8] ، که دلالت بر این دارد که ، به طور دقیق ، میانگین آن وجود ندارد. با این حال ، توزیع Cauchy دارای یک شکل ساعت متقارن با محوریت صفر است ، دارای میانگین صفر است [8] و با تعریف کلی تر از ادغام ، میانگین آن نیز می تواند صفر تلقی شود [9]. بنابراین ، به طور متوسط ، خطا در آخرین دوره Eq. 4 صفر است و اصطلاح لغو می شود که باعث می شود نسبت بین جلسه یک تخمین بی طرفانه از نسبت دو عامل جلسه باشد. هنگامی که دو جلسه بیش از یک شرط مشترک دارند ، یک نسبت بین جلسه برای هر جفت شرایط تطبیق محاسبه می شود. از آنجا که ما با اثرات چند برابر روبرو هستیم ، میانگین هندسی این نسبت ها [10] در ماتریس نسبت بین جلسه استفاده می شود.

در مجموعه داده های مثال (شکل (شکل 1) ، 1A) ، جلسات 1 و جلسه 6 هیچ شرایطی مشترک ندارند و بنابراین ، یک نسبت بین جلسه نمی تواند به طور مستقیم برای این جفت جلسات محاسبه شود. برای اینکه بتوانید فاکتورهای جلسه مناسب را بدون از دست دادن مجموعه داده ها مانند جلسات 1 و 6 محاسبه کنید ، باید نسبت های بین جلسه را جایگزین کنید. محاسبه جایگزینی برای یک نسبت گمشده در ستون J و ردیف I (r)_j/i) از نسبت شناخته شده در آن ستون (به عنوان مثال r_j/n) و دو نسبت دیگر از این دو ردیف در ستون دیگر (r_k/iو r_k/n). یک مقدار جایگزین برای نسبت گمشده r_j/iسپس به صورت r محاسبه می شود_j/i = R_j/n × R_k/i/R_k/nبشراگر چنین جایگزینی برای همه r ممکن محاسبه شود_j/n, R_k/i، و r_k/nمیانگین هندسی تمام مقادیر بهترین تخمین از نسبت گمشده خواهد بود_j/i.

از آنجا که محصول تمام فاکتورهای جلسه در مدل چند جلسه برابر است با 1 ، میانگین هندسی ستون I در این ماتریس نسبت بین جلسه ، تخمینی از ضریب تصحیح برای جلسه I است:

تغییر بین جلسه در مجموعه داده های اصلی اکنون می تواند با تقسیم هر مقدار اندازه گیری شده توسط ضریب جلسه مربوطه (معادله 6) حذف شود:

داده های اصلاح شده در شکل شکل 1d 1d نشان داده شده است.

تخمین عوامل جلسه با رویکرد حداکثر احتمال

در مدل افزودنی و چند ضلعی مخلوط فوق ، اصطلاح خطا به طور معمول با یک انحراف استاندارد σ توزیع می شود. وقتی تعریف می کنیم = σ · f_حرفو = y_من/ σ با y_iبه عنوان میانگین ارزش در هر شرایط (Y_i = Y_{منظور داشتن} + E_i؛به Eq مراجعه کنید. 3) مدل را می توان به عنوان y بازنویسی کرد_{عکسبرداری}= ( + خطا_{عکسبرداری}/ σ) ، و سپس می توان نشان داد که به طور معمول با میانگین 0 و انحراف استاندارد 1. بر اساس این شکل از مدل ، احتمال مجموعه مشاهده شده از y توزیع می شود._niتوسط Eq داده شده است. 7

که احتمال یافتن هر یک از مشاهدات فردی است_niبا توجه به f_nو y_i، ضرب (π) برای همه مشاهدات.

اگر این عملکرد احتمال برای = y حداکثر باشد_{من ، حداکثر}, = F_{n ، حداکثر}، سپس y_{من ، حداکثر}و f_{n ، حداکثر}هنگامی که اولین مشتقات در y و f از ورود به این عملکرد احتمال برابر 0. معادلات تخمین برای y یافت می شوند_iو f_nاز یکدیگر مستقل نیستند و بنابراین ، یک روش تکراری برای برآورد مجموعه های y لازم است_{من ، حداکثر}و f_{n ، حداکثر}مولفه های.

این رویکرد حداکثر احتمال منجر به مجموعه ای از عوامل جلسه می شود (f_n) و همچنین تخمین های شرط (y_i). برای هر دو مجموعه از پارامترها ، رویکرد حداکثر احتمال همچنین خطاهای استاندارد را تخمین می زند که می تواند برای مقایسه عوامل و شرایط در بین یکدیگر استفاده شود. توجه داشته باشید که در این رویکرد بخشی از تغییر در مجموعه داده ها به تغییر اثر عاملی در یک جلسه نسبت داده می شود. این برخلاف رویکرد نسبت فوق است که در آن فاکتورها فرض می شود.

Table Table1 1 gives an example of the calculation of session factors using each of the methods on a simulated data set. The session factors of both methods, as well as the condition means resulting from the maximum likelihood method, are very close to the values used in the simulation. The session factors resulting from the ratio approach fall within the confidence interval of those estimated with the maximum likelihood method (t-test; all P>0. 6). یک برنامه رایانه ای که تصحیح فاکتور را با هر دو روش انجام می دهد ، در صورت درخواست در دسترس است: Rotcaf=tcejbus؟ln. avu. cma@secivres-baloib.

میز 1

نتایج کاربرد هر دو روش برای برآورد عوامل جلسه در یک مجموعه داده شبیه سازی شده. یک آزمایش چند جلسه با 5 جلسه و 5 شرط با 5 مشاهده در هر ترکیب جلسه و شرایط شبیه سازی شد. هر شرایط در 4 جلسه مختلف اندازه گیری شد. در شبیه سازی داده ها ، میانگین کلی به 100 تنظیم شده است و انحراف استاندارد به 10 تنظیم شده است. عوامل و اثرات شرایط در جدول آورده شده است. فاکتورهای جلسه تخمین زده شده همه نزدیک به عوامل مورد استفاده در شبیه سازی برای هر دو روش هستند و عوامل تخمین زده شده با روش نسبت در واریانس مواردی که با رویکرد حداکثر احتمال تخمین زده می شوند ، هستند. شرط به معنای تخمین زده شده با روش حداکثر احتمال نزدیک به مقادیر مورد استفاده در شبیه سازی است.

استفاده از تصحیح عاملی در مجموعه داده های مولکولی بیولوژی

نتیجه عادی سازی و استاندارد سازی مجموعه داده های ناقص از شکل 1A 1A در شکل های شکل 1b 1b و and1c 1c نشان داده شده است و در بالا مورد بحث قرار گرفت. نتیجه تصحیح عاملی (رویکرد نسبت) در شکل 1D ترسیم شده است. 1dعوامل تخمین زده شده توسط حداکثر احتمال منجر به نمودار قابل تشخیص نمی شود. کاهش فاصله بین خطوط جلسه در شکل 1D ، 1D ، در مقایسه با شکل 1A ، 1a ، نشان می دهد که تغییر بین جلسات بین جلسات با موفقیت حذف شده است. این همچنین با کاهش تغییر در شرایط پس از تصحیح فاکتور نشان داده شده است (شکل . 2a 2a و شکل شکل 2D را مقایسه کنید). 2d). تفاوت باقیمانده بین خطوط جلسه (شکل (شکل 1D) 1D) منعکس کننده مؤلفه غیر مبهم از تغییر است ، که نمایانگر مؤلفه خطا در مدل چند جلسه است (معادله 3). در مقایسه با عادی سازی (شکل ها (شکل 1b 1b و 2b) 2b) و استاندارد سازی (شکل (شکل 1C 1C و 2C) 2C) تنوع درون شرط پس از تصحیح فاکتور به وضوح کاهش می یابد ، نشان می دهد که عامل آن را نشان می دهد. تصحیح در حذف تنوع بین جلسه مؤثرتر است. هنگامی که از داده های اصلاح شده عامل برای آزمایش تفاوت بین هر یک از سازه های DNA و ساخت 1 استفاده می شود ، فقط سازه های 3 و 6 به طور معنی داری متفاوت نیستند (آزمون t ؛ P = 0. 095 و P = 0. 071 ، به ترتیب ؛ شکل.. 2d). 2d). همان آزمایش اعمال شده برای داده های عادی و استاندارد نشان می دهد که به ترتیب فقط 2 و 1 DNA ، که به طور قابل توجهی با ساخت 1 متفاوت است (ستاره ها در شکل. شکل 2b 2b و and2c). 2C). این نتایج نشان می دهد که قدرت مقایسه آماری به وضوح پس از تصحیح فاکتور افزایش می یابد.

استفاده از تصحیح فاکتور در مجموعه داده های ویروسی شناسی

ما همچنین اثربخشی تصحیح فاکتور با یک مجموعه داده را نشان می دهیم که از حوزه ویروس HIV-1 سرچشمه می گیرد. هنگام آزمایش انواع مختلف HIV-1 ، ساخت کلونهای عفونی عفونی و آزمایش ظرفیت آنها برای بیان ژن و تولید ویروس در هنگام ترانسفکشن سلولها ، یک روش استاندارد است. به عنوان نمونه ، شکل شکل 3A 3A آزمایشی را نشان می دهد که در آن 6 نوع HIV-1 به سلول منتقل شده و تولید ویروس با اندازه گیری پروتئین ساختاری ویروسی CA-P24 در مایع رویی کشت در دو روز پس از ترانسفکشن مورد بررسی قرار گرفت. میانگین و انحراف استاندارد داده ها از هفت جلسه اندازه گیری نشان داده شده است. این مجموعه داده های ویروسی HIV-1 یک مجموعه کامل بود. تنوع بین جلسه ، که به دلیل تغییر در راندمان ترانسفکشن و سایر تنوع تجربی است ، به وضوح منجر به انحراف استاندارد نسبتاً بزرگ می شود. عادی سازی داده ها انحراف استاندارد را کاهش می دهد ، اما تغییر در نمونه "کنترل" از بین می رود (شکل (شکل 3B). 3B). از آنجا که مجموعه داده کامل است ، تصحیح با استاندارد سازی در از بین بردن تغییرات بین جلسه مؤثر است اما منجر به از بین رفتن مقیاس اندازه گیری اصلی می شود (شکل (شکل 3C) 3C). استفاده از تصحیح فاکتور برای از بین بردن تنوع بین جلسه ، انحراف استاندارد را برای هر ویروس کاهش می دهد اما مقیاس اصلی را حفظ می کند. مجموعه ای از آزمونهای T بین نوع وحشی و هر یک از انواع دیگر HIV-1 نشان داد که با توجه به داده های اندازه گیری شده (شکل (شکل 3A) 3A) فقط نوع D با نوع وحشی تفاوت معنی داری دارد (P = 0. 022)بشرپس از تصحیح فاکتور (شکل (شکل 3D) 3D) تفاوت معنی داری از نوع وحشی می تواند برای انواع C ، D و LAI مشاهده شود (مقادیر P به ترتیب: 0. 033 ، 0. 001 و 0. 003).

تولید ویروس انواع HIV-1. کلون مولکولی HIV-1 LAI و مشتقات با مکانیسم اصلاح شده از تنظیم رونویسی [13] و تغییر در ژن TAT ویروسی به سلولهای C33A منتقل شدند. تولید ویروس در دو روز پس از ترانسفکشن اندازه گیری شد. این آزمایش هفت بار تکرار شد. پاسخ: میانگین مقادیر با انحراف استاندارد داده های مشاهده شده. ب: عادی سازی داده ها با سازه WT در هر جلسه 100 ٪ تعیین شده است. ج: داده های اصلاح شده پس از استاندارد سازی. D: داده ها پس از حذف تغییرات بین جلسه با تصحیح فاکتور. WT: سازه HIV-RTTA با ژن تات نوع وحشی. A-D: انواع HIV-RTTA با ژنهای TAT جهش یافته (که در جای دیگر توصیف می شود). LAI: کلون پرولی HIV-LAI با مکانیسم اصلاح نشده تنظیم رونویسی. ستاره نشان دهنده تفاوت آماری معنی داری بین نوع ویروس و WT است (آزمون T ؛ P<0.05). The number of observations per variant is 8.

بحث

در این مقاله ، تصحیح عاملی به عنوان یک روش مؤثر برای از بین بردن تغییرات بین جلسه از آزمایش های چند جلسه ای توصیف شده است. با استفاده از مجموعه داده ها از زمینه های زیست شناسی مولکولی و ویروسی شناسی ، ما نشان می دهیم که تصحیح عامل به طور مؤثر تنوع بین جلسه را در هر دو مجموعه داده کامل و ناقص از بین می برد. از مجموعه داده های اصلاح شده می توان برای آزمایش آماری تفاوت بین شرایط استفاده کرد ، زیرا خطای آماری تحت تأثیر تصحیح فاکتور قرار نمی گیرد. علاوه بر این ، مقیاس مقادیر اصلاح شده عامل را می توان در نظر گرفت که مقیاس اندازه گیری اصلی را نشان می دهد.

مشابه عادی سازی و استاندارد سازی ، تصحیح فاکتور براساس یک مدل ضرب برای تنوع مشاهده شده در چنین آزمایش های چند جلسه ای است (معادله 3). پس از عادی سازی ، استاندارد سازی و تصحیح فاکتور ، الگوی اختلاف بین شرط بسیار مشابه است (شکل. (شکل 2 و 3). 3). با این حال ، در عادی سازی ، شرایط کنترل واریانس خود را از دست داده و واریانس تمام شرایط دیگر از زمان تصحیح فاکتور بزرگتر است (شکل. شکل 2b 2b و and2d ، 2d ، 3b 3b و and3d). 3D). به عبارت دیگر ، تغییراتی که در شرایط کنترل از بین می رود به شرایط دیگر اضافه شده است. این امر به این دلیل است که کاربران عادی سازی به طور ضمنی ، اما غیرقانونی ، فرض می کنند که شرایط کنترل بدون خطا است. از آنجا که مجموعه داده های ویروسی HIV-1 کامل بود ، مجموعه داده های استاندارد شده و تصحیح شده بسیار مشابه هستند (شکل. شکل. شکل 3C 3C و AND3D). 3D). با این حال ، هنگامی که استاندارد سازی به یک مجموعه داده ناقص اعمال می شود ، هم میانگین جلسه و هم انحراف استاندارد جلسه برای شرایط گمشده اصلاح نمی شود ، که ممکن است تغییر در برخی شرایط را افزایش دهد. تغییراتی که برای مثال مشاهده می شودسازه های 2 و 5 در مجموعه داده های مولکولی بیولوژی به وضوح پس از استاندارد سازی نسبت به تصحیح فاکتور بزرگتر است (شکل. شکل 2C 2C و AND2D). 2d). در تصحیح فاکتور ، تمام داده های موجود برای برآورد فاکتورهای جلسه به همان اندازه وزن دارند ، که امکان استفاده از آن برای مجموعه داده های ناقص را فراهم می کند.

یک روش جایگزین برای برآورد فاکتورهای چند برابر در مدل افزودنی و چند ضلعی مختلط استفاده از ANOVA دو طرفه پس از تحول لگاریتمی داده ها است که فاکتور جلسه چند برابر را به یک مؤلفه افزودنی تبدیل می کند. استفاده از ANOVA دو طرفه بدون تعامل بین جلسه و شرایط سپس منجر به یک فاکتور در هر جلسه می شود. توجه داشته باشید که اثرات شرط ناشی از این ANOVA دو طرفه به عنوان اثرات چندگانه محاسبه می شود و این باعث می شود که تخمین های فاکتور به طور حاشیه ای متفاوت از موارد محاسبه شده یا با روش نسبت یا برآورد حداکثر احتمال (داده ها نشان داده نشده باشد) متفاوت باشد.

دو روش برای برآورد عوامل جلسه شرح داده شده در این مقاله نتایج کمی متفاوت را نشان می دهد زیرا رویکرد حداکثر احتمال بخشی از تغییر را به عوامل جلسه تخمین زده شده اختصاص می دهد. روش نسبت را می توان به عنوان یک مورد خاص مشاهده کرد ، که در آن کاربر فرض می کند که عامل ضرب برای هر اندازه گیری در یک جلسه یکسان است. بنابراین ، روش حداکثر احتمال به طور کلی از دو روش کاربرد دارد. در این مقاله معادلات برای رویکرد حداکثر احتمال برای یک طرح آزمایشی یک طرفه تهیه شده است. از آنجا که تمرکز این مقاله ارائه جایگزینی برای عادی سازی نامعقول است که اغلب در آزمایشگاه اعمال می شود ، ما تخمین حداکثر احتمال فاکتورهای جلسه را برای طرح های آزمایشی پیچیده تر دنبال نکردیم. با این حال ، طراحی فعلی محاسبه فاکتورهای جلسه را امکان پذیر می کند که گویی طرح یک طرفه است و استفاده از این عوامل. داده های تصحیح شده از فاکتور حاصل از آن می توانند در یک بسته آماری برای تجزیه و تحلیل بیشتر استفاده شوند.

هنگامی که از تصحیح فاکتور استفاده می شود ، جلسات دیگر به دلیل از دست دادن برخی از نقاط داده در روش آزمایشگاهی دیگر لازم نیست. علاوه بر این ، تصحیح فاکتور ، تصحیح مجموعه داده های چند جلسه ای را که لزوماً ناقص هستند امکان پذیر می کند زیرا شرایط بیشتری باید آزمایش شود تا در هر جلسه قابل اندازه گیری باشد. علاوه بر این ، به دلیل اینکه شرایط کنترل دیگر در هر جلسه مورد نیاز نیست ، می توان از منابع با کارآمدتر استفاده کرد. خطای کوچکتر در شرایط پس از استفاده از تصحیح فاکتور ، در مقایسه با عادی سازی و استاندارد سازی ، قدرت آزمایشات آماری فرضیه های بیولوژیکی را افزایش می دهد و تعداد مورد نیاز مشاهدات را کاهش می دهد.

نتیجه

ما تصحیح فاکتور را به عنوان یک روش مؤثر و کارآمد برای از بین بردن تغییرات بین جلسه در آزمایش های چند جلسه ارائه می دهیم. این روش در یک برنامه رایانه ای آسان برای کاربردی اجرا شد که در صورت درخواست در دسترس است: ROTCAF=TCEJBUS؟LN. AVU. CMA@SECIVRES-BALOIB. تصحیح فاکتور به زیست شناسان تجربی کمک می کند تا سوزن اطلاعات بیولوژیکی مرتبط را در یونجه تنوع بین جلسه پیدا کنند.

مواد و روش ها

مجموعه داده های مولکولی بیولوژی

هدف از مطالعه ای که از این مجموعه داده گرفته شده است ، بررسی فعالیت رونویسی ترکیبات مختلف تقویت کننده ، پروموتور و عناصر اولترون اول ژن گلوتامین موش (GS) است [1]. برای این منظور ، سازه های DNA حاوی توالی های مختلف تقویت کننده-پروموتر در مقابل ژن گزارشگر لوسیفراز با استفاده از الکتروپاتوما به سلولهای کبدی FTO-2B منتقل شدند. سلولها با یک کلرامفنیکلول استیل ترانسفراز پلاسمید (PRSVCAT) منتقل شدند. شانزده ساعت پس از ترانسفکشن ، محیط تازه شد و 48 ساعت دیگر سلولها برداشت و برای فعالیت لوسیفراز و CAT آزمایش شدند. فعالیت سازه DNA آزمایش شده به عنوان نسبت بین فعالیت لوسیفراز و فعالیت CAT بیان شد.

مجموعه داده های ویروس HIV-1

سازه های HIV-1 با مکانیسم اصلاح شده تنظیم رونویسی [13] و تغییر در ژن تات ویروسی (که در جای دیگر توصیف می شود) به سلولهای دهانه رحم C33A انسان همانطور که قبلاً توضیح داده شد منتقل شدند [14]. تولید ویروس توسط CA-P24 ELISA در نمونه های مایع رویی دو روز پس از ترانسفکشن اندازه گیری شد. این آزمایش هفت بار تکرار شد.

منافع رقابتی

نویسنده (ها) اعلام می کنند که آنها هیچ علاقه رقیب ندارند.

کمک های نویسندگان

WL ایده استفاده از نسبت های بین جلسه را برای اصلاح تغییر بین جلسه در مجموعه داده های ناقص و JR مدل داده های افزودنی و چند برابر مخلوط برای این منظور انجام داد. HT روش حداکثر احتمال را برای برآورد عوامل جلسه توسعه داد. JR و HT هر دو روش را در یک برنامه رایانه ای پیاده سازی کردند و JR نسخه خطی را تهیه کرد. سیستم عامل ، AD و BB با تهیه مجموعه داده های نمونه و آزمایش روش در آزمایش های ترانسفکشن کمک می کنند. همه نویسندگان نسخه خطی نهایی را می خوانند ، اصلاح و تصویب کردند.